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動物細胞高純內質網分離試劑盒產品說明書

主要用途

動物細胞高純內質網分離試劑是一種旨在通過機械或化學處理、差速和等密度離心方法，從動物細胞中分離出活性完整而高度純化的內質網細胞器組分的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其制備物產量高，活性保證，純度可達99％。適合于各種動物原代和培養細胞（人體、老鼠、兔子等）內質網的制備?？梢员挥糜诩毎?/span>P450系統外源化合物（xenobiotics）代謝、脂類代謝、內質網膜蛋白和腔內蛋白等研究。產品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩定，分離產量高。

技術背景

內質網（endoplasmic reticulum；ER）是真核生物的細胞器組分，構成細胞內小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互連接的網絡結構，負責蛋白轉譯、折疊和轉運成為細胞膜成分（例如跨膜受體和其它整合膜蛋白等）或分泌型蛋白（例如消化性酶），負責鈣離子區隔（sequestration），以及糖原、固醇類和其它大分子的生產和儲存等功能。內質網分成三種：粗面內質網（Rough endoplasmic reticulum；RER）、滑面內質網（Smooth endoplasmic reticulum；SER）和肌質網（sarcoplasmic reticulum；SR）。根據細胞代謝的需要，粗面內質網和滑面內質網會互相轉換。粗面內質網通過核糖體合成蛋白質并分類；滑面內質網進行固醇、碳水化合物和藥物代謝等。肌質網的主要功能為儲存和釋放鈣離子。內質網的分離是現代細胞生物學研究的常用手段之一：第一，通過機械或化學方法破裂組織細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得內質網；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的內質網。 

產品內容

清理液（Reagent A）        100毫升

裂解液（Reagent B）        100毫升

凈化液（Reagent C）        10毫升

活性液（Reagent D）        100微升

強化液（Reagent E）        5毫升

保存液（Reagent F）        50毫升

高純液（Reagent G）        25毫升

分層液（Reagent H）        25毫升

產品說明書           1份

保存方式

保存凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（12028）或PBS緩沖溶液（12033）：用于清理細胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離

細胞培養液（12052）：用于細胞處理所需的培養基

50毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

6毫升超速離心管：用于超高速離心的容器

4℃臺式離心機：用于樣品制備

4℃超速離心機：用于樣品制備

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

試管固定支架：用于離心管固定支撐

3號針筒和18號針頭：用于收集樣品

實驗步驟

一、 組織勻漿法

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）凍融，然后移出移取10微升活性液（Reagent D）、 1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為裂解工作液。然后進行下列操作。

1． 準備5至10瓶75cm²細胞培養瓶的細胞（5 X 10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養表面

2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去

3． 重復實驗步驟2一次

4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面

5． 置入37℃培養箱3分種

6． 輕輕手擊震動培養瓶，使細胞脫落，

7． 分別加入10毫升用戶自備的細胞培養液

8． 移入一個50毫升錐形離心管

9． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g

10． 小心抽去上清液

11． 加入10毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻細胞

12． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g

13． 小心抽去上清液

14． 加入5毫升預冷的裂解工作液

15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群

16． 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器

17． 在冰槽里用勻漿幫勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項7）

18． 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管

19． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g

20． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解細胞

21． 放進4℃超速離心機離心15分鐘，速度為12000g

22． 小心移出上清液到預冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrialfraction；PMF）

23． 放進4℃超速離心機再次離心60分鐘，速度為100000g

24． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內質網組分

25． 即刻加入500微升保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物

26． 置于冰槽里備用

27． 準備1個6毫升超速離心管

28． 加入2.5毫升高純液（Reagent G）

29． 小心沿著管壁，在高純液（Reagent G）上面，一滴一滴加入2.5毫升分層液（Reagent H）（注意：避免晃動）

30． 小心沿著管壁，在分層液（Reagent H）上面，一滴一滴加入500微升上述內質網組分（注意：避免晃動）

31． 小心放進4℃超速離心機再次離心30分鐘，速度為130000g

32． 小心取出超速離心管：可見上端三分之一處（滑面內質網）和下端三分之一處（粗面內質網）棕色或乳黃色樣品帶

33． 小心抽去滑面內質網樣品帶以上的液體

34． 小心收集滑面內質網樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純滑面內質網樣品

35． 進一步抽去粗面內質網樣品帶以上的液體

36． 小心收集粗面內質網樣品帶到另一個2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純滑面內質網樣品

37． 分別加入1至2毫升保存液（Reagent F）

38． 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為100000g

39． 小心抽去上清液

40． 分別加入500微升保存液（Reagent F），混勻

41． 放進－70℃冰箱里保存

二、 化學處理法

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）凍融，然后移出移取10微升活性液（Reagent D）、1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為裂解工作液。然后進行下列操作。

1． 準備5至10瓶75cm²細胞培養瓶的細胞（5 X 10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養表面

2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去

3． 重復實驗步驟2一次

4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面

5． 置入37℃培養箱3分種

6． 輕輕手擊震動培養瓶，使細胞脫落

7． 分別加入10毫升用戶自備的細胞培養液

8． 移入一個50毫升錐形離心管

9． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g

10． 小心抽去上清液

11． 加入10毫升預冷的清理液（Reagent A）

12． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g

13． 小心抽去上清液

14． 加入5毫升預冷的裂解工作液

15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

16． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次

17． 加入500微升預冷的強化液（Reagent D）

18． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

19． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8）

20． 加入5毫升預冷的裂解液（Reagent B），輕輕搖動試管混勻

21． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g

22． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解細胞

23． 放進4℃超速離心機離心20分鐘，速度為12000g

24． 小心移出上清液到預冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得線粒體組分（post mitochondrialfraction；PMF）

25． 放進4℃超速離心機再次離心60分鐘，速度為100000g

26． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內質網組分

27． 即刻加入500微升保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物

28． 置于冰槽里備用

29． 準備1個6毫升超速離心管

30． 加入2.5毫升高純液（Reagent G）

31． 小心沿著管壁，在高純液（Reagent G）上面，一滴一滴加入2.5毫升分層液（Reagent H）（注意：避免晃動）

32． 小心沿著管壁，在分層液（Reagent H）上面，一滴一滴加入500微升上述內質網組分（注意：避免晃動）

33． 小心放進4℃超速離心機再次離心30分鐘，速度為130000g

34． 小心取出超速離心管：可見上端三分之一處（滑面內質網）和下端三分之一處（粗面內質網）棕色或乳黃色樣品帶

35． 小心抽去滑面內質網樣品帶以上的液體

36． 小心收集滑面內質網樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純滑面內質網樣品

37． 進一步抽去粗面內質網樣品帶以上的液體

38． 小心收集粗面內質網樣品帶到另一個2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純粗面內質網樣品

39． 分別加入1至2毫升保存液（Reagent F）

40． 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為100000g

41． 小心抽去上清液

42． 分別加入500微升保存液（Reagent F），混勻

43． 放進－70℃冰箱里保存

注意事項

1． 本產品為10次（5 X 10⁷動物細胞）操作

2． 操作時，須戴手套

3． 操作時，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent F）

4． 所有操作均須在4℃或以下狀態進行

5． 建議使用足夠的樣品量

6． 建議嚴格控制操作時間

7． 通常勻化次數為20至40下（或細胞顆粒群消失為止）達到80％的組織細胞裂解為理想狀態，但不同的細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加勻化次數

8． 通常孵育5分鐘（不宜超過5分鐘）達到80％的組織細胞裂解為理想狀態，但不同的細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數

9． 對于難以裂解的細胞，例如HeLa細胞，采用物理勻漿法是優先推薦的技術處理

10． 腦組織的內質網沉淀顆粒非常松動，注意操作損失

11． 通常5 X 10⁷動物細胞的內質網含量為500至1000微克蛋白

12． 本產品所獲得的內質網純度達95%以上

13． 內質網的標志蛋白是NADPH細胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）；建議使用 組織NADPH細胞色素C還原酶活性比色法定量檢測試劑盒－50303.2

14． 粗面內質網的標志是核糖體RNA（ribosome RNA）；建議使用 RNA熒光（RiboGreen）定量檢測試劑盒——20129

15． 本公司提供系列亞細胞結構分析試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定分離的內質網維持正?；钚?/span>

3． 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶